Real-time fluorescence quantitative PCR ከእያንዳንዱ የ polymerase chain reaction (PCR) ዑደት በኋላ በዲ ኤን ኤ አምፕሊፊኬሽን ምላሽ ውስጥ ፍሎሮፎርን በመጠቀም አጠቃላይ የምርት መጠንን ለመለካት ዘዴ ነው።ዘዴው በውስጥም ሆነ በውጫዊ የማጣቀሻ ዘዴዎች ለመፈተሽ ናሙና ውስጥ የተወሰኑ የዲኤንኤ ቅደም ተከተሎችን ለመለካት ጥቅም ላይ ይውላል.ከተመሠረተበት ጊዜ ጀምሮ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ምርመራዎች በቤተ ሙከራ አስተማሪዎች ዘንድ ተወዳጅ እየሆኑ መጥተዋል።
Fluorescence PCR መርህ፡ Fluorescence PCR በመጀመሪያ TaqManPCR ተብሎ የሚጠራው እና በኋላም ሪል-ታይም ፒሲአር በ PE (PerkinElmer) በዩኤስኤ በ1995 የተሰራ አዲስ የኒውክሊክ አሲድ መጠየቂያ ቴክኒክ ነው። ቴክኒኩ የተመሰረተው በፍሎረሰንት የተለጠፈ መፈተሻ ወይም ተጓዳኝ በመጨመር ነው። የመጠን ተግባሩን ለማሳካት የፍሎረሰንት ቀለም ወደ መደበኛ PCR።መርሆው-የ PCR ምላሽ በሚቀጥልበት ጊዜ የ PCR ምላሽ ምርቶች ይከማቻሉ እና የፍሎረሰንት ምልክት ጥንካሬ በእኩል መጠን ይጨምራል.በእያንዳንዱ ዑደት የፍሎረሰንስ ኢንትንት ሲግናል ይሰበሰባል ስለዚህም የምርት መጠን ለውጥን በፍሎረሰንስ ጥንካሬ ለውጥ መከታተል እና በዚህም የፍሎረሰንስ ማጉያ ከርቭ ግራፍ ማግኘት እንችላለን።
በአጠቃላይ የፍሎረሰንስ ማጉላት ከርቭ በሶስት ደረጃዎች ሊከፈል ይችላል፡- የፍሎረሰንስ ዳራ ሲግናል ምዕራፍ፣ የፍሎረሰንስ ሲግናል ገላጭ ማጉላት ደረጃ እና የፕላቶ ደረጃ።ከበስተጀርባ ሲግናል ደረጃ፣ የተጨመረው የፍሎረሰንስ ምልክት በፍሎረሰንስ ዳራ ምልክት ተሸፍኗል እና የምርት መጠን ላይ ለውጦች ሊታወቁ አይችሉም።በፕላታ ደረጃ፣ የማጉላት ምርቱ ከአሁን በኋላ በከፍተኛ ሁኔታ አይጨምርም፣ በመጨረሻው ምርት መጠን እና በመነሻ አብነት መጠን መካከል ምንም ቀጥተኛ ግንኙነት የለም፣ እና የመነሻ ዲ ኤን ኤ ቅጂ ቁጥር በመጨረሻው PCR ምርት መጠን ሊሰላ አይችልም።በፍሎረሰንት ሲግናል ገላጭ ማጉላት ሂደት ውስጥ ብቻ በ PCR ምርት መጠን እና በመነሻ አብነት መጠን መካከል ቀጥተኛ ግንኙነት አለ ፣ እና ይህንን በዚህ ደረጃ ለመለካት መምረጥ እንችላለን።ለቁጥር እና ለማነፃፀር ምቾት ፣ ሁለት በጣም አስፈላጊ ፅንሰ-ሀሳቦች በእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ቴክኒክ ውስጥ ገብተዋል-የፍሎረሰንስ ጣራ እና የሲቲ እሴት።
ጣራው በፍሎረሰንት ማጉያ ከርቭ ላይ በሰው ሰራሽ መንገድ የተቀመጠ እሴት ነው።የ PCR ማጉላት ገላጭ ደረጃ.
ሲቲ እሴት፡ በእያንዳንዱ የምላሽ ቱቦ ውስጥ ያለው የፍሎረሰንስ ሲግናል የተቀመጠውን የጎራ እሴት ለመድረስ ያደረጋቸው የዑደቶች ብዛት ነው።
በሲቲ እሴት እና በመነሻ አብነት መካከል ያለው ግንኙነት፡ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የእያንዳንዱ አብነት የሲቲ እሴት ከዚ አብነት የመነሻ ቅጂ ቁጥር ሎጋሪዝም ጋር ቀጥተኛ ግንኙነት እንዳለው፣ የመነሻ ቅጂ ቁጥሩ ብዙ ቅጂዎች ሲጨመሩ፣ የሲቲው ቁጥር ያነሰ ይሆናል። ዋጋ.የሲቲ እሴቶች በአንጻራዊ ሁኔታ የተረጋጋ ናቸው።አንድ መደበኛ ኩርባ የሚታወቅ የመነሻ ቅጂ ቁጥር ባለው ስታንዳርድ ሊሠራ ይችላል፣ አግድም መጋጠሚያው የመነሻ ቅጂ ቁጥሩን ሎጋሪዝም የሚወክልበት እና የቋሚው መጋጠሚያ ከዚህ በታች ባለው ምስል እንደሚታየው የሲቲ እሴትን ይወክላል።
ስለዚህ ያልታወቀ ናሙና የሲቲ እሴትን በማግኘት የናሙና መነሻ ቅጂ ቁጥር ከመደበኛው ከርቭ ሊሰላ ይችላል።
የሲቲ እሴቱ ቋሚ አይደለም እና በተለያዩ ናሙናዎች እና የተለያዩ መሳሪያዎች ላይ ተጽእኖ ሊያሳድር ይችላል, ምንም እንኳን ተመሳሳይ ናሙና በተመሳሳይ መሳሪያ ላይ 2 ጊዜ ቢደጋገም, የሲቲ እሴት ሊለያይ ይችላል.
አሃዛዊ የፍሎረሰንት ዳሰሳ፡ መጠናዊ የፍሎረሰንት መመርመሪያዎች ጥቅም ላይ በሚውሉት ጠቋሚዎች ላይ በመመስረት ወደ ፍሎረሰንት መመርመሪያዎች እና የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች ሊከፋፈሉ ይችላሉ።የፍሎረሰንት መመርመሪያዎች የቢኮን ቴክኖሎጂ (የሞለኪውላር ቢኮን ቴክኖሎጂ፣ በአሜሪካን ታጂ የተወከለው)፣ TaqMan probes (በABI የተወከለው) እና FRET ቴክኖሎጂ (በRoche የተወከለው)፣የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች የሳቹሬትድ ፍሎረሰንት ማቅለሚያዎችን እና ያልተሟሉ የፍሎረሰንት ቀለሞችን ያካትታሉ፣ ያልተሟሉ የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች የተለመደው ተወካይ SYBRGreen I ነው፣ እሱም አሁን በብዛት ጥቅም ላይ ይውላል።የሳቹሬትድ የተለመደው የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች ተወካይ SYBRGreenⅠ;የሳቹሬትድ የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች ኢቫግሪን፣ ኤልሲጂሪን፣ ወዘተ ናቸው።
SYBRGreenI ለፍሎረሰንት PCR በተለምዶ ጥቅም ላይ የሚውለው የዲኤንኤ ማሰሪያ ቀለም ነው፣ እሱም በተለየ መልኩ ከድርብ-ክር ዲ ኤን ኤ ጋር ይያያዛል።በነጻ ግዛቱ፣ SYBRGreenI ደካማ ፍሎረሰንት ያመነጫል፣ ነገር ግን አንዴ ከዲ ኤን ኤ ጋር ከተገናኘ፣ ፍሎረሰንሱ በ1000 እጥፍ ይጨምራል።ስለዚህ፣ በምላሽ የሚወጣው አጠቃላይ የፍሎረሰንት ምልክት ባለ ሁለት ገመድ ያለው ዲ ኤን ኤ ካለው መጠን ጋር ተመጣጣኝ ነው እና የማጉላት ምርቱ ሲጨምር ይጨምራል።
ባለ ሁለት ገመድ የዲ ኤን ኤ ማሰሪያ ቀለሞች ጥቅሞች፡ ቀላል የሙከራ ንድፍ፣ 2 ፕሪመር ብቻ ያስፈልጋል፣ መመርመሪያዎችን መንደፍ አያስፈልግም፣ በርካታ ጂኖችን በፍጥነት ለመፈተሽ ብዙ መመርመሪያዎችን መንደፍ አያስፈልግም፣ የማቅለጫ ነጥብ ከርቭ ትንተና የማከናወን ችሎታ፣ የመለኪያውን ልዩነት ይፈትሹ የማጉላት ምላሽ, ዝቅተኛ የመነሻ ዋጋ, ጥሩ አጠቃላይነት እና ስለዚህ በአገር ውስጥ እና በውጭ አገር በምርምር ውስጥ በብዛት ጥቅም ላይ ይውላል.
የፍሎረሰንት መፈተሻ ዘዴ (ታክማን ቴክኒክ)፡- PCR ማጉላት ሲደረግ፣ ጥንድ ፕሪመር ከተወሰነ የፍሎረሰንት መጠይቅ ጋር ይጨመራል።መመርመሪያው ሳይበላሽ ሲቀር, በሪፖርተሩ ቡድን የሚወጣው የፍሎረሰንት ምልክት በተቀጣጣይ ቡድን ይያዛል እና በ PCR መሳሪያ አይታወቅም;በ PCR ማጉላት ወቅት (በኤክስቴንሽን ደረጃ) የ 5'-3' የ Taq ኢንዛይም የመፍቻ እንቅስቃሴ ኢንዛይማዊ በሆነ መልኩ መፈተሻውን ያዋርዳል, ይህም የሪፖርተሩን የፍሎረሰንስ ቡድን እና የፍሎረሰንስ ቡድን ያጠፋል.
የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR መተግበሪያዎች።
የሞለኪውላር ባዮሎጂ ጥናት;
1. የቁጥር ኑክሊክ አሲድ ትንተና.ስለ ተላላፊ በሽታዎች መጠናዊ እና ጥራት ያለው ትንተና፣ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ወይም ቫይረሶችን መለየት፣ ለምሳሌ በቅርብ ጊዜ የተከሰተው የኢንፍሉዌንዛ ኤ (H1N1) ወረርሽኝ፣ የጂን ኮፒ ቁጥሮችን ትራንስጀኒክ እፅዋትንና እንስሳትን መለየት፣ የአር ኤንአይ ጂን ኢንአክቲቬሽን መጠን፣ ወዘተ.
2. ልዩነት የጂን መግለጫ ትንተና.በሕክምና ናሙናዎች መካከል የጂን አገላለጽ ልዩነቶችን ማነፃፀር (ለምሳሌ የመድኃኒት ሕክምና ፣ የአካል ሕክምና ፣ የኬሚካል ሕክምና ፣ ወዘተ) ፣ የልዩ ጂኖች ልዩነት በተለያዩ ደረጃዎች እና የ cDNA ማይክሮአራይ ማረጋገጫ ወይም የልዩነት መግለጫ ውጤቶች።
3. SNP ማግኘት.ነጠላ ኑክሊዮታይድ ፖሊሞፊዝምን መለየት ለተለያዩ በሽታዎች ተጋላጭነትን ወይም ለተወሰኑ መድኃኒቶች ግለሰባዊ ምላሽን ለማጥናት አስፈላጊ ነው ፣ እና በሞለኪውላዊ ቢኮኖች ብልሃተኛ መዋቅር ምክንያት የ SNP ቅደም ተከተል መረጃ ከታወቀ በኋላ ቀላል እና ትክክለኛ ነው ። ይህንን ዘዴ ለከፍተኛ የ SNP ግኝት ይጠቀሙ።
4. ሜቲላይዜሽን መለየት.ሜቲሌሽን ከብዙ የሰው ልጅ በሽታዎች ጋር ይያያዛል በተለይም ካንሰር ሲሆን ሌይርድ ሜቲላይት የተባለ ቴክኒክ ከማጉላት በፊት ዲ ኤን ኤን በማከም ያልተጣራ ሳይቶሲን ዩራሲል ይሆናል እና ሚቲላይትድ ሳይቶሲን የማይጎዳ ሲሆን ሚቲላይትድ እና ያልተስተካከለ ዲ ኤን ኤ ለመለየት ልዩ ፕሪመር እና የታክማን ምርመራዎችን በመጠቀም .የበለጠ ስሜታዊ።
የሕክምና ምርምር;
1. የቅድመ ወሊድ ምርመራ፡ ሰዎች በተለወጡ የዘረመል ንጥረ ነገሮች ምክንያት የሚመጡ በዘር የሚተላለፉ በሽታዎችን ማከም የማይችሉ ሲሆን እስካሁን ድረስ በቅድመ ወሊድ ክትትል የሚወለዱ ህጻናትን ቁጥር በመቀነስ የተለያዩ በዘር የሚተላለፉ በሽታዎች እንዳይከሰቱ ማድረግ ብቻ ነው።ይህ በነፍሰ ጡር ሴቶች በቀላሉ ተቀባይነት ያለው ወራሪ ያልሆነ ዘዴ ነው.
2. በሽታ አምጪ ተህዋስያንን መለየት፡- የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ትንታኔ እንደ ጎኖኮከስ፣ ክላሚዲያ ትራኮማቲስ፣ ማይኮፕላዝማ ሶሊየም፣ ሂውማን ፓፒሎማ ቫይረስ፣ ሄርፒስ ፒስክስ ቫይረስ፣ የሰው ልጅ የበሽታ መከላከያ ቫይረስ፣ ሄፓታይተስ ቫይረስ፣ የኢንፍሉዌንዛ ቫይረስ፣ ማይኮባክቲሪየም ሳንባ ነቀርሳ እና EBሳይቶሜ ቫይረስን የመሳሰሉ በሽታ አምጪ ተህዋሲያንን በቁጥር ለመወሰን ያስችላል።ከተለምዷዊ የፈተና ዘዴዎች ጋር ሲነፃፀር ከፍተኛ ስሜታዊነት, ዝቅተኛ ናሙና መጠን, ፈጣን እና ቀላልነት ጥቅሞች አሉት.
3. የመድሃኒት ውጤታማነት ግምገማ፡- የሄፐታይተስ ቢ ቫይረስ (HBV) እና የሄፐታይተስ ሲ ቫይረስ (ኤች.ሲ.ቪ) መጠናዊ ትንታኔ እንደሚያሳየው በቫይራል ሎድ እና በአንዳንድ መድሃኒቶች ውጤታማነት መካከል ያለውን ግንኙነት ያሳያል።በላሚቩዲን ሕክምና ወቅት የኤችቢቪ-ዲ ኤን ኤ ሴረም ደረጃ ከቀነሰ እና እንደገና ከጨመረ ወይም ካለፈው ደረጃ ካለፈ ይህ የቫይረስ ሚውቴሽንን ያሳያል።
4. ኦንኮጄኔቲክ ምርመራ፡ የዕጢ እድገት ዘዴ ገና ግልፅ ባይሆንም በተዛማጅ ጂኖች ውስጥ ያለው ሚውቴሽን የኦንኮጅኒክ ለውጥ መንስዔ እንደሆነ በብዙዎች ዘንድ ተቀባይነት አለው።ኦንኮጅንን መጨመር እና ሚውቴሽን በብዙ እጢዎች የመጀመሪያ ደረጃዎች ላይ ሊታይ ይችላል.የእውነተኛ ጊዜ ፍሎረሰንት መጠናዊ PCR በጂኖች ውስጥ ሚውቴሽንን በመለየት ረገድ ውጤታማ ብቻ ሳይሆን የኦንኮጅንን አገላለጽ በትክክል ማወቅ ይችላል።ይህ ዘዴ ቴሎሜራስ hTERT ጂን፣ ሥር የሰደደ granulocytic leukemia WT1 ጂን፣ ኦንኮጅኒክ ኤር ጂን፣ የፕሮስቴት ካንሰር PSM ጂን፣ እና ከዕጢ ጋር የተገናኙ የቫይረስ ጂኖችን ጨምሮ የተለያዩ የጂኖች አገላለጾችን ለመለየት ጥቅም ላይ ውሏል።
በwww.DeepL.com/Translator የተተረጎመ (ነጻ ስሪት)
የልጥፍ ሰዓት፡- ጁን -21-2022